MARCADORES MOLECULARES
Un marcador es considerado como un carácter cuyo patrón de herencia puede definirse en un nivel morfológico (fenotípico), bioquímico o molecular.Se asocian marcadores con caracteres, para esclarecer la probabilidad de relación entre un locus genéticos y un carácter determinadoDesde el punto de vista de un análisis de relación genética los marcadores moleculares son:
- Puntos específicos fijados a un cromosoma
- La herencia es completamente Mendeliana
Marcadores moleculares
Cualquier señal o traza molecular que nos permite estudiar un caracter (Fenotipo) o gen (Genotipo) asociado a este, y de herencia mendeliana (Marcador Genético) y detectada como secuencias de ADN o proteínas.
Detección de variabilidad a nivel de secuencias de ADN.
Fuentes de origen de Marcadores moleculares
1. ADN cromosómico (genómico)
ADN codificante
ADN no codificante
ADN altamente repetido
2. ADN extracromosómico
ADN mitocondrial
ADN de cloroplastos
Tipos de marcadores moleculares
• RFLP (Restriction fragment length polymorphic): Este método consiste en la obtención de fragmentos de ADN, debido al uso de endonucleasas capaces de reconocer sitios de unión altamente específicos. Las endonucleasas de restricción son enzimas que cortan el ADN en secuencias específicas presentes en el organismo, generando fragmentos. Estos fragmentos pueden variar en tamaño y número entre los grupos analizados. Estos fragmentos son analizados mediante southern blot, en el cual el ADN digerido, es separado mediante electroforesis, transferido a una membrana y visualizado mediante sondas específicas.
• PCR-RFLP: Este método corresponde a una variante de obtención más rápida quela mencionada anteriormente. Debido al aumento en el conocimiento del genoma de diversos organismos, junto con el diseño de diversos partidores universales, actualmente es posible obtener miles de copias del fragmento de ADN, mediante PCR (Polymerase Chain Reaction). Por lo cual en este proceso se realiza la digestión en forma posterior a la obtención de las copias por PCR del fragmento de interés, los fragmentos son visualizados mediante electroforesis simple en gel de agarosa. Este marcador entrega información codominante.
• RAPD (Random amplified polymorphic DNA): Este método fue desarrollado en los 90’ y consiste en la amplificación al azar de secuencias cortas de nucleótidos, mediante la utilización de un par de pequeños partidores de 8 a 10 bp que reconocen sitios anónimos en el genoma total, los que son amplificados por PCR. Mediante este método es posible obtener una alta cantidad de fragmentos que son visualizados mediante electroforesis en gel de agarosa. Este tipo de marcadores amplifica regiones anónimas por lo cual se define como un marcador dominante a diferencia de los marcadores antes descritos y se considera que cada fragmento corresponde a un locus bi-alélico, que es leído como presencia o ausencia de un producto amplificado.
Debido a su rapidez puede ser utilizado para análisis poblacional en un alto número de individuos, pero con la certeza de la mantención de las condiciones de amplificación para evitar cambios en los patrones de amplificación.
• AFLP (Amplified fragment length polymorphism): Este método consiste en la utilización de enzimas de restricción junto a amplificación por PCR. En esta técnica se utilizan adaptadores de secuencias conocidas, que se unen a fragmentos de ADN generados por digestión del ADN genómico total. Los adaptadores se unen a los extremos de fragmentos de ADN de secuencias conocidas y son usados como sitios de unión de los partidores para amplificación por PCR, los fragmentos obtenidos son visualizados mediante electroforesis. Estos resultados son analizados mediante presencia-ausencia de un locus dado, por lo cual corresponden a un marcador dominante. Este método se ha llegado a usar en forma más amplia debido al alto polimorfismo capaz de detectar y al bajo costo de su aplicación en relación a la información obtenida. Su desventaja esta dada en la dificultad de la lectura manual o el requerimiento de equipo automatizado para su rápida lectura.
• Microsatélites SSR (Simple sequence repeats): Estos consisten en unidades de 2 a 5 nucleótidos los cuales se encuentran repetidos en tándem. Las regiones adyacentes a estas zonas generalmente son conservadas, por lo cual es posible diseñar partidores que permitan obtener miles de copias de estas zonas mediante amplificación por PCR. Los resultados de este análisis pueden ser visualizados mediante gel de agarosa de alta resolución o mediante lectura automatizada en un secuenciador de ADN. El polimorfismo de los microsatélites es basado en la variación en el número de repeticiones en tándem de los alelos de un locus. Estos han llegado a ser muy utilizados por su alta abundancia en el genoma, la alta variabilidad debido a su elevado número de alelos por locus y por su forma de herencia codominante, lo que permite aplicar una variedad de análisis estadísticos poblacionales.
• Secuenciación: Consiste en la lectura de las bases nucleotídicas presentes en ungen o fragmento de ADN. Este método requiere de amplificación por PCR de múltiples copias del fragmento de ADN objetivo para la realización de una lectura automatizada mediante un secuenciador de ADN. La gran ventaja de este método es que alcanza la mayor resolución posible en la obtención de la información genética y su desventaja se relaciona con los costos y los requerimientos de equipos automatizados.
– ADN nuclear: Es posible realizar secuenciación de genes nucleares de copia única, como las repeticiones del ADN ribosomal, el cual ha sido ampliamente utilizado por presentar múltiples copias en el genoma, alta variabilidad y por poseer regiones adyacentes conservadas que ha permitido definir partidores.
– ADN mitocondrial: Este ADN posee una tasa mutacional mayor que el ADN nuclear, lo cual lo hace presentar una mayor resolución para resolver relaciones entre grupos más cercanos y además existen en múltiples copias en el citoplasma, las cuales son idénticas entre si por su ausencia de recombinación y herencia uniparental (solo herencia maternal). El genoma mitocondrial en su mayoría posee genes codificantes, sin embargo presenta un fragmento donde se inicia la replicación y transcripción, el cual presenta una alta tasa de mutación principalmente por ser no codificante, este corresponde a la región control o D-loop, para el cual se han diseñado partidores universales o específicos en un diverso número de taxa.
• SNP (Single nucleotide polymorphism): este marcador corresponde a la detección de un cambio en una sola base nucleotídica por otra base alternativa en una posición en la secuencia de ADN. Dicha posición de la base nucleotídica con secuencias alternativas en el ADN genómico corresponde a un SNP (Vignal et al., 2002). Este marcador ha mostrado ser mayoritariamente bi-alelico, determinado por la baja tasa de mutación de las sustituciones únicas que originan los SNP. Las ventajas de este marcador son su herencia codominante y su gran abundancia en el genoma. Sus desventajas se encuentran asociadas a los métodos de genotipificación, los cuales incluyen equipamiento de alto costo como microchips, espectrometría de masa, PCR cuantitativa o secuenciación.
• EST (Expressed sequence tags): Secuencias de genes expresados que son generadas desde secuenciación al azar de clones de ADN complementario (Adams et al., 1991). Este método permiteidentificar genes y analizar su expresión por medio de perfiles de expresión de genes a partir de algún tejido específico. Este tipo de marcador permite el desarrollo de microarreglos de ADN complementario que se utiliza para el análisis de genes expresados diferencialmente. Los microarreglos se basan en la unión de bases complementarias que permiten identificar los genes activos del tejido de un organismo en base a su unión dentro de la placa que contienen todos los genes conocidos de una especie. De esta forma es posible detectar mediante el «encendido/apagado» de cada gen la transcripción dentro de las células del tejido específico.
Aplicación de los marcadores moleculares
Actualmente es posible utilizar los marcadores de ADN en todas las áreas de las ciencias biológicas, debido a que han llegado a transformarse en una poderosa herramienta, encontrando su utilización en áreas como: taxonomía y sistemática, ecología, biología evolutiva y agricultura entre otras (ver revisiones en Parker et al., 1998; Feral, 2002; Vignal et al., 2002; Zhang y Hewitt, 2003; Liu y Cordes, 2004). Sin embargo, se hace más relevante entender la aplicación de los marcadores moleculares en base a las problemáticas que permite resolver
USO DE MARCADORES MOLECULARES EN PLANTAS; APLICACIONES EN FRUTALES DEL TRÓPICO
RESUMEN
Uso de marcadores moleculares en plantas; aplicaciones en frutales del trópico. En el presente trabajo se realizó una revisión bibliográfica sobre el uso de marcadores moleculares en plantas, con énfasis en el uso de los mismos en especies frutales del trópico. Comprende aspectos relativos al uso e importancia, ventajas, desventajas y características, evolución de las principales metodologías de marcaje a través del tiempo y una explicación de las técnicas de uso más frecuente. Por último, se presenta una lista de las publicaciones más relevantes hasta el año 2005. En ésta se indican los autores, la especie estudiada, el objetivo del trabajo, la técnica empleada así como los principales resultados obtenidos
Álvaro Azofeida Delgado
Aplicación de los marcadores moleculares
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